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γ-PGA(聚麩胺酸)

γ-PGA(gamma-Polyglutamic acid 聚麩胺酸) 為最近開發成功一種最重要全天然生物可分解性高分子(圖一)。由於其構成成份相當奇特因而具有許多一般意想不到的結構特性和多功能特性,極適合於跨領域的工業應用,具高度經濟價值。γ-PGA的工業化生產技術平台已在台灣成形,但其特殊的化學、生化、營養、生醫、農業和工業上應用則有待積極開發和進一步加以商業化推廣應用。由於γ-PGA為極新的生物高分子物(Biopolymer),其基本資訊和應用才剛開始,非常缺乏。本文將提供學界、業界有關γ-PGA之基本資訊以幫助業界從科技與學術的角度來認識此新產品之化學、物理及生物學特性,進而促進此新生技產品在各工業領域之應用。γ-(D,L)-PGA, γ-(D)-PGA, 和γ-(L)-PGA等統稱為γ-PGA。

圖一 全天然生物可分解性高分子

非解離的γ-PGA

為一價鹽類之結構, M(I )γ-PGA

為二價鹽類 M(II) γ-PGA之結構

M (I) = , 或 M(II) = 或。
Figure 1. The chemical structure of γ-polyglutamic acid (γ-PGA) and the salts of γ-PGA. (A) the acidified form of γ-PGA, (B) the M(I) γ-PGA, (C) the M(II) γ-PGA, where M(I) = , or ; M(II) =, or .

γ-(D)-PGA之液態發酵生產機制

Salvage Bioconversion Pathway

γ-(D)-PGA為最早被Ivanovics et al 發現存在於Bacillus anthracis 之細胞壁內。γ-PGA可以經由二種不同的生物化學轉化機制聚合而成。其一為de novo Bioconversion Pathway,此為固態醱酵生產所進行者,不需要L-GA(L-Glutamic acid)當作誘導物質。另一方法為液態醱酵生產,所進行的生化轉化聚合機制為 Salvage Bioconversion (見圖二),此法需L-GA當作誘導物質。液態醱酵方法適用於大量生產γ-PGA,所以也是工業上大量生產唯一之選擇製法。γ-PGA的生合成大部份在細胞對數生長期或穩定生長期間累積,先聚合成於細胞體內,然後再排出體外。由於是親水性高分子物質,因此主要生產效率是受限於γ-PGA之內在粘度(Intrinsic Viscosity)。

圖二 生化轉化聚合機制為 Salvage Bioconversion

Salvage Bioconversion Pathway Figure 2. γ-PGA biosynthesis via salvage pathway². The microbes are stimulated to produce γ-PGA by the addition of L-glutamic acid.(adapted from Hara, T., et al.,1982)

枯草桿菌納豆菌變種(Bacillus subtilis var. natto)均有生合成γ-PGA之能力,但生產γ-PGA之產率、分子量和D/L比例則視菌屬種類及生長培養液中成份而略有差異。表一所列為已知γ-PGA生產菌例。

表一 已知γ-PGA生產菌例

合成γ-(D,L)-PGA之醱酵菌 The bacteria producing γ-(D,L)-PGA

高產效率而且是符合美國 FDA所訂定 GRAS 規範的Bacillus subtilis var. natto 菌已被成功地開發出來並運用到液態醱酵生產製程,證明Salvage Bioconversion Pathway 是適於大量生產γ-PGA的最有效益生物合成機制。台灣在近年政府極力推展發展生物科技產業並在經濟部的產官學和專業合作方案下,γ-PGA新生技事業已極成功地逐步邁出一條大道。在未來的幾年內台灣應可以順利地建立成為全球最具競爭優勢的新興生技產業。

γ-(D,L)-PGA(聚麩胺酸)之化學結構與特性

γ-(D,L)-PGA之構成單元為GA(glutamic acid),GA含有三個活性官能基:α-NH2,α-COOH及γ-COOH。三個功能基之化學活性依序為α-NH2>α-COOH>γ-COOH,其 酸解離常數各為pKα = pK1 = 2.13~2.2,pKγ= pK2 = 4.25~4.32,pK3 = 9.7~9.95。α-COOH與α-NH2縮水結合成為α-peptide bond(α-蛋白鍵)。γ-COOH與α-NH2縮水結合成為γ-peptide bond(γ-蛋白鍵)。L-GA在一般化學聚合反應中生成α-peptide bond的α-(D,L)-PGA,但L-GA在醱酵過程中,則大部份變旋光成為D-GA,然後D-GA和L-GA則共同行聚合而成γ-peptide bond結合的γ-(D,L)-PGA,在一般的蛋白物質中,胺基酸之間均以α-peptide bond結合,所以均能被proteases所水解。唯獨γ-peptide bond(γ-蛋白鍵)結合而成的則除了γ-GTP(γ-glutamyl transpeptidase)以外均不會被一般的protease所水解,所以γ-(D,L)-PGA構成一定程度的抗菌性。因而在食品、化妝品和生醫材料方面之應用呈現相當程度的抗微生物與食品安全性。

在γ-PGA分子中,由於強力的α-COOH與γ-peptide鍵之 -NH2- 所形成的氫鍵(hydrogen bonding)再加上conformational change(分子結構上之外在形態改變),使得α-COOH基變成不解離狀態以至pKα = pK1 = 0,使整個γ-(D,L)-PGA分子成為極緊密而收縮的α-helix conformation,因而呈現強烈的hydrophobic。

α-(L)-PGA和γ-(D,L)-PGA均存在著五種不同的conformational states(分子外型結構狀態):α-helix,β-sheet,random coil,helix-coil transition和enveloped aggregation等。α-(L)-PGA之每一個repeat unit在random coil state之unit length為0.35nm,直徑為1.4nm,而在α-helix state之unit length則為0.15nm,直徑為1.1nm,α-(L)-PGA之pK2 = pKγ = 4.375相較於Glutamic acid中之pK2 = pKγ = 3.9。圖三中顯示α-(L)-PGA在水相中隨pH之高低而有不同,存在著不同的conformational states。α-(L)-PGA於均勻水相中於pH = 4.5~5.5之間,游離態的α-helix state轉變成random coil state,但在固定態(adsorbed)的α-(L)-PGA,其轉變pH則較高約為5<pH<7(見圖四),顯示固定態的α-(L)-PGA之hydrogen bonding比游離態的強度較為弱小。

圖三

在均勻水相中聚麩胺酸(γ-PGA)之螺旋態結構(α-helix)隨pH值而改變。固定態γ-PGA轉形成α-helix之pH值比游離態γ-PGA為高。(adapted from Pefferkorn E et al.)

圖四

聚麩胺酸(γ-Poly-(D)-glutamic acid)之319左手式螺旋狀結構

合成γ-(D,L)-PGA之醱酵菌

The bacteria producing γ-(D,L)-PGA

ORD(Optical Rotatory Dispersion)測試顯示由於同分子內的羧基間氫鍵使得α-(D)-PGA形成至少四種結構功能態(conformational states)。

其一為不解離的游離酸(unionized free acid)(Zanuy D.)(13)呈α-helix的結構,如圖四和五所示。317 helix是由-NH-基與COOH基之Carboxyl間之氫鍵構成,319 helix 則由-COOH基中之-CO與-OH-基間的氫鍵構成,每三個glutamic acid單位繞成一圈,其圈距為4.8 A,具有4個氫鍵。此等氫鍵(inter-carboxyl hydrogen bonding)極強使得α-(D)-PGA之α-helix結構變得很緊密縮小堅固而變成不溶於水。

圖五顯示隨pH值升高,疏水性的α-helix中的氫鍵消失因而轉換成random coil的結構形態,親水性大為增加而成為帶陰電性(polyanionic)的表面,水溶性大大地增加。γ-(D)-PGA之pKα = 4.06,而α-(D)-PGA之pKγ = 5.5~6.0,相較於glutamic acid中之pKα = 2.2,pKγ = 3.9,明顯地減弱氫鍵強度。

圖五

聚麩胺酸〔γ-Poly-(D,L)-glutamic acid〕在水中之解離度

γ-(D,L)-PGA及其鹽類結構分析

生物高分子的分子結構、特性和功能性能提供必要的技術訊息給各領域的使用者參考,以便判斷可能性和有效性等指標。最重要的技術資訊包括明確的分子結構、功能基群和內涵的特性等。具代表性的有1H-NMR圖,13C-NMR圖,FT-IR圖,DSC熱分析圖,TGA熱分析圖,酸鹼特性圖,水溶解度圖,水溶液粘度圖以及結構型態與功能特性數據等對於各領域的使用者都是極為重要的最基本技術資訊。γ-(D,L)-PGA及其重要的鹽類之上述大部份數值各列於表二。圖六為γ-(D,L)-PGA之酸鹼滴定圖。圖七為γ-(D,L)-PGA鈉鹽之粘度、溫度、濃度關係圖。

表二

聚麩胺酸(γ-(D,L)-Poly-glutamic acid)及其鹽類之結構特性分析數據

圖六 γ-(D,L)-PGA之酸鹼滴定圖

0.2N NaOH(ml)

Ca(OH)2(g)

5M NH4OH

圖七

γ-(D,L)-PGA鈉鹽之pH與粘度關係圖

γ-(D,L)-PGA鈉鹽之溫度與粘度關係圖

γ-(D,L)-PGA鈉鹽之濃度與粘度關係圖

γ-(D,L)-PGA之工業化量產

大量的γ-(D,L)-PGA最早被發現存在於日本納豆食品(經醱酵過之小黃豆)所含具有高粘稠性的拉絲中,近55﹪以上的粘絲固形組成物為γ-(D,L)-PGA,其餘40%為Levan。γ-(D,L)-PGA之正確命名化學成份和結構等則是最近幾年才被確認。γ-(D,L)-PGA可利用微生物枯草桿菌納豆變異種(Bacillus subtilis var. natto)等,將L-GA經由生物化學轉化機制-Salvage Bioconversion Pathway(見圖3所示)聚合而成之單一種胺基酸高分子(mono-amino acid polymer)(見圖一所示)。天然的γ-PGA含有左旋光性的L-GA和右旋光性的D-GA,其D/L比例約為1:1到4:1。一般γ-PGA之聚合度約為1000到15000,分子量在100K到3000K之間。產率約為3~6﹪γ-PGA,視所使用的菌株和培養基之營養成份而略有不同。國內大廠所生產之 γ- (D,L) - PGA,其 D / L比 = 52 %:48 %。其他已知的γ-(D,L)-PGA生產株特性列如表一所示。

γ-(D,L)-PGA在工業上之應用

γ-(D,L)-PGA之經濟價值就存在於其全天然生物可分解特性,可以工業化大量生產,有完全的生體相容性、無毒性,和生物學上之多功能性。納豆在日本做為食品已有上千年之歷史,在納豆之粘絲中存在著約55﹪以上之成份為γ-(D,L)-PGA之物質(為鈉鹽和銨鹽之混合物)。天然的γ-(D,L)-PGA之分子量約為130萬到300萬daltons,聚合度(degree of polymerization)約為1000到15,000個麩胺酸。γ-(D,L)-PGA鹽類可以再修飾(modify)成更有吸水及保水之Hydrogel(水膠)可以大大改進γ-(D,L)-PGA之多功能特性,賦予更有效的儲存和緩釋(controlled release)之功能,在醫藥、農業和化妝品工業之應用,效果非常顯著。而γ-(D,L)-PGA之成膜特性和柔軟(soft and tender)之特色在化妝品工業、土木工程以及人纖的加工應用更是指日可期。其對於鈣鎂鹽類之特殊溶解和錯合功能更有助于鈣吸收和減緩骨質疏鬆增進健康等功效。總之γ-(D,L)-PGA所具有的結構上功能性和生體相容性以及生物可分解性,使其極具經濟價值,明顯地可以發現其在跨工業領域的應用。表3列述γ-(D,L)-PGA在各種工業上的潛在應用。

表三 聚麩胺酸及其衍生物在工業上之應用

工業別 產品別 化學與生化功能特性
食品工業 增粘劑/安定劑
動物飼料營養助劑
抗凍劑
改進液體食品之粘性,改進食品質地及口感等,促進鈣吸收與骨質成長,增加蛋殼硬度,改善蛋白及蛋黃品質,提昇冷凍食品之抗凍性
健康與保健食品 健康營養助劑 促進鈣吸收,改善骨質疏鬆問題
化妝品工業 保溼劑 改善保養皮膚,減少皺紋
淨水處理/都市用水 健康營養助劑 去除水中重金屬和放射性金屬離子
污水處理工程 生物可分解性絮凝劑 可代替polyacryamide或PAC
醫藥工業 緩釋藥物載體 癌症藥劑或基因療法之生物相容性的載體
農業應用 土壤改良,種子被覆 高吸水/保水功能/促進作物生長
衛生器材製品 尿布,衛生棉 高吸水劑
特種功能性製品 生物晶片,LCD面板 生物體相容性
其他 生物可分解性塑膠
生物可分解性纖維
生物可分解特性

參考文獻

  1. Ivanovics, G., V. Bruckner : Chemische und immunologische Studien uber den Mechanimus der Milzbrandinfektion und Immunitat; die chemische Struktur der Kapdelsubstanz des Milzbrandbasillus und der serologisch identischen spezifischen Substanz des Bacillus mesentericus. Z. Immunitatsforsch. 90 : 304-318 (1937).
  2. Hara, T., Y. Fuzio, S. Ueda : Polyglutamate production by Bacillus subtilis (natto) J. Appl. Biochem. 4 : 112-120 (1982).
  3. Ogawa, Y., F. Yamaguchi, K. Yuasa, Y. Tahara : Efficient production of γ-polyglutamic acid by Bacillus subtilis (natto) in jar fermenters. Biosci. Biotech. Biochem. 61: 1684-1687 (1997).
  4. Ito, Y., T. Tanaka, T. Ohmachi, Y. Asada : Glutamic acid independent production of poly (γ-glutamic acid ) by Bacillus subtilis TAM-4. Biosci. Biotechnol. Biochem. 60 : 1239-1242 (1996).
  5. Cromwick, A. M., R. A. Gross : Effects of manganese (Ⅱ) on Bacillus licheniformis ATCC9945A physiology and γ-poly (glutamic acid) formation. Int. Biol. Macromol. 16 : 265-275 (1995).
  6. Kunioka, M., A. Gota : Biosythesis of poly (γ-glutamic acid ) from L-glutamic acid, citric acid, and ammonium sulfate in Bacillus subtilis subtilis IFO 3335 Appl. Microl. Biotechnol. 40 : 867-872 (1994).
  7. Kubota, H., T. Matsunobu, K. Uotani, H. Takebe, A. Satoh, T. Tanaka, M. Tanguchi : Production of poly (γ-glutamic acid) by Bacillus subtilis F-2-01. Biosci. Biotechnol. Biochem. 57 : 1212-1213 (1993).
  8. Ward, R. M., R. F. Anderson, F. K. Dean : Polyglutamic acid production by Bacillus subtilis NRRL-B2612 grown on wheat gluten. Biotechnol. Bioeng. 5 : 41-48 (1963)l,水膠
  9. Saito, T., N. Iso, H. Mizuno, H. Kaneda, Y. Suyama, S. Kawamura, S. Osawa : Conformation change of a natto mucin in solution. Agr. Biol. Chem. :38 : 1941-1946 (1973).
  10. Cheng, C., Y. Asada, T. Aaide : Production of γ-polyglutamic acid by Bacillus subtilis A35 under denitrifying conditions. Agric. Biol. Chem. 53 : 2369-2375 (1989).
  11. Rydon, H. N. : Polypeptides. Part Ⅹ. The optical rotary dispersion of poly γ-D-glutamic acid. J. Chem. Soc. pp. 1328-1333 (1964).
  12. Pefferkorn E., A. Schmitt , R. Varogui, : Helix-coil transition of poly(α, L-glutamic acid) at an interface: correlation with static and dynamic membrane properties. Biopolymers 21 : 1451 (1982).
  13. Zanuy, D., C. Aleman, S. Munoz-Guerra : On the helical conformation of un-ionized poly (γ-glutamic acid). Int. J. Biol. Macromol. 23 : 175-184 (1998).